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一個實驗室得到一個新的細胞株后，首先要把該細胞株培養(yǎng)擴增后凍存起來。細胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細胞時有備份可用，另外幾乎所有細胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結(jié)果的一致，一般細胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細胞化凍培養(yǎng)再使用。細胞冷凍過程有四個要點：細胞的收獲、保護劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。
1、 細胞的收獲
用來凍存的細胞一般選擇在細胞約鋪滿 90% 的時候，這時細胞生長狀態(tài)好，細胞數(shù)量也多，并且在收獲細胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細胞開始時方法和平時一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細胞再重懸，活細胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細胞保存的最終細胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬 細胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。
2、保護劑的使用
細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細胞特別是雜交瘤細胞在凍存時使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細胞的培養(yǎng)液混合。
3、細胞凍存的速率
細胞的冷凍速率最適控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導致細胞損害。對大多數(shù)細胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細胞先在-20℃1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜(如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。
4、儲存環(huán)境
細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。
注意事項：
1. 細胞凍存原則為“慢凍"，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。當細胞快速冷凍時，水和離子往往會留在細胞中，細胞內(nèi)冰晶的形成會撕裂和刺穿細胞膜。相反，如果細胞冷凍太過緩慢，則細胞外的水會在細胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過滲透作用逸出，但增加了可能有毒的細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度。因此對于大多數(shù)細胞，最佳冷凍速率在每分鐘1℃之間。
2. DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，延緩溫度下降速度，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護細胞的作用。
3. 凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積(4℃時)，復蘇存活率在80%～90%，對原代培養(yǎng)細胞，以90%血清凍存更為有效。
4. 細胞離心后盡量吸干凈上清液，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液。
5. DMSO溶于培養(yǎng)基時，將釋放大量熱量，所以細胞凍存液需提前配制，冷卻后再使用，不能直接將DMSO加入含有細胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細胞。
6. 細胞凍存和復蘇過程中，不可避免會損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低。推薦密度為300-500w/mL。
7. 細胞懸液加入凍存液以后盡量短時間的在常溫放置，DMSO常溫下對細胞損傷大，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒。
