商品屬性：

末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）是一種不依賴于模板的 DNA 聚 合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到 DNA 分子的 3’羥基端。帶有 突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈 DNA 分子均可作為 TdT 的 底物，加尾長度可達(dá) 5~300nt。本酶經(jīng)電子重構(gòu)架技術(shù)篩選， 使其可以在 45°C 高溫下反應(yīng)，從而避免因 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)造 成的加尾效率下降。 該酶廣泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修飾堿 基（如 ddNTP，DIGdUTP）標(biāo)記 DNA 3’末端、TdT 介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記技術(shù)（細(xì)胞凋亡的原位檢測）等試驗(yàn)。

活性定義：37 ℃ 60 分鐘內(nèi)，催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羥基末端中所需的酶量定義為 1 個(gè)活性單位
熱失活：75°C 20min。
儲(chǔ)存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事項(xiàng)
1、適量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性喪失。
2、金屬離子螯合劑，較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對(duì) Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 數(shù)的計(jì)算，長度為 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

本試劑采用穩(wěn)定高效的 RT-PCR 預(yù)混體系，是以 RNA 為模板進(jìn)行一步法 RT-PCR 的專用試劑。其原理為用基因特 異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得第一鏈 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成第一鏈 cDNA），再使 用基因特異性正向引物和反向引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在同一 反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到 PCR 的全部過程。反應(yīng)體 系中已含有電泳所需的指試劑（藍(lán)色和黃色），反應(yīng)后可以 直接進(jìn)行電泳。 在本試劑盒中，將耐熱 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 預(yù)混液；反應(yīng) Buffer、dNTP 以及 電泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此 使得操作更加簡單便，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于平端克隆和 DNA 測 序。
主要優(yōu)勢：
? 耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶可在55℃反應(yīng)能更好的打開復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，只需 10min 即可完成逆轉(zhuǎn)錄。
? DNA 聚合酶為熱啟動(dòng)型高保真酶，能夠有效的抑制非特異性反應(yīng)且具有較高的校正活性，酶激活僅需 2min。
? 具有寬泛的模板量兼容性，10 ng~1μg 都可有效擴(kuò)增。
? 反應(yīng)過程中無需開蓋，避免了操作過程中的污染危害。
組分
名稱 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
儲(chǔ)存：請(qǐng)置于-20°C，可保存 2 年；避免反復(fù)凍融。
注意：
1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高，第一次使用之前要離心收集至反應(yīng)管底部，吸取時(shí)應(yīng)緩慢小心。
2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶，反應(yīng)配制可在常溫進(jìn)行，但各組分應(yīng)-20°C 保存。
實(shí)驗(yàn)操作和反應(yīng)條件：
1. 按以下組分配制反應(yīng)液
RNA（病毒 DNA/RNA 樣品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
基因特異性上游引物（10μM） 0.8 μl
基因特異性下游引物（10μM） 0.8 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
注意：超過 1 μg 的 RNA 模板量會(huì)抑制 PCR 反應(yīng)，建議第一次可使用 200 ng 的 RNA 模板，然后根據(jù)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。
2. 在 PCR 儀上按以下條件進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng):
55°C， 10min 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
95°C， 2min 失活 M-MLV，并激活高保真聚合酶
95°C， 20s 30~40 cycles
TM°C， 20s
72°C ，
2Kb/min
72°C， 2min 末端延伸
3. PCR 反應(yīng)結(jié)束后，可取 5 μl 產(chǎn)物直接進(jìn)行電泳檢測。預(yù)混液中已經(jīng)包含綠色染料，無需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 電泳時(shí)，藍(lán)色指示劑指示 3~5 kb，黃色指示劑指示<50 bp。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：